שיעור ;4 20.2.08 אם מסתכלים על מפה סכמטית של הגנום של.E coli נרא שיש לו גנום קטן: 40 מליון bp כ. - 4000 גנים. אנחנו מצא שחלק גדול מהגנים מוקדשים לתהליך ההכפלה. חלק מהגנים עוסקים באופן ישיר (ליגאזות, הליקאזות וכיו"ב) וחלקם באופן עקיף (פורינים, פירמידינים וכיו"ב). כלומר- בתהליך השכפול מעורבים אנזימים וחלבונים רבים. ניתן לחלק את תהליך ההכפלה לכמה שלבים, בהתאם לחלבונים שפועלים בהם. התא צריך לעבור הכנות להכפלה. הכנות אלו מתבצעים בשלב ה- pre-priming ובשלב ה-.priming בשלב ה- pre-priming פועלים חלבונים מסוג.origin recognizing אלו חלבונים שיכולים לזהות אתרים ב- DNA ולהפוך אותם לזמינים להמשך. בחלק מהמקרים מדובר על חלבון בודד, ובחלק מהם הוא קומפלקס שלם complex) Origin recognizing בשמרים). בשלב ה- priming המערכת הופכת להיות מערכת של template primer ה. - priming של סינטזת DNA יכול להתבצע בכמה דרכים: הדרך המוכרת לנו- סינטזה של,primer אבל זה יכול להיות גם באמצעות nick כאשר הקבוצה ה- 3-OH יכולה לשמש.primer בחלק מהמערכות מתרחשת סינטזה מיוחדת של RNA (המיוצר על ידי,(primase ובחלקם מדובר פשוט ביצירה של primer על ידי.RNApoly ישנם גם מקרים שבהם חלבון יכול לשמש,primer או trna שמשמש כפריימר (כמו בוירוס.(HIV כאשר שני שלבים אלו מסתיימים, המערכת מוכנה לשלב העיקרי של הסינטזה- האלונגציה. זהו שלב מורכב, שמתקיימים בו תהליכים מלבד קשירת האנזים וסינטזת הנוקליאוטידים. כדי שפולימראז יוכל לרוץ על ה- DNA ולסנטז DNA יש מערכת שדואגת שהאנזים יוכל להחליק על הגדיל מבלי ליפול. מערכת זו קרויה clamp - polymerase clamp הוא חלבון שיוצר מבנה של טבעת שמורכבת מ- 6 מתחמים, ואליה קשור ה-.DNApoly הטבעת יכולה להחליק ע"ג הגדיל, והפולימראז מסנטז את הגדיל. ה. DNApolyIII הוא האנזים העיקרי שמסנטז את גדילי ה- DNA של.E. coli לאנזים יש 7 תתי יחידות (כאשר הוא קשור ל- clamp דרך יחידה β?) בתאים שלנו גם קיים,clamp המחובר ל-.DNApolyΔ לפולימראז דלתא ה- clamp הוא,PCNA משום שהרבה מאד שנים השתמשו בו בתור סמן לתהליך סרטני (בזמן גידול יש סינטזה של DNA ועליה בכמות החלבון). גם PCNA הוא חלבון טבעתי, שיכול לורץ באופן רציף על הגדיל. קיימת גם מערכת שלמה שמטעינה את ה- clamp ה: - loader.clamp השלב המגביל step) (rate limiting של הסינטזה הוא התהליך של הכנסת הנוקליאוטיד הראשון. ככל שהוא יצטרך לעשות זאת פחות פעמים- מהירות הסינטזה תעלה. מעבר לטעינה של הפולימראז מתקיימים גם תהליכים אחרים- יש לנו שינויים במבנה הראשוני, השניוני והשלישוני. הליקאזות גורמים ל- unwinding של הגדיל, ומספקים את ה- template (שינוי במבנה שניוני). טופואיזומראז משחרר את המתחים החיוביים שמתפתחים בקדמת מזלג ההכפלה. תוך כדי הסינטזה ולאחריה מתרחש תהליך של הרחקת פריימרים excision) (primer ב. - coli.e זה מתרחש על ידי פולימראז I. באוקריוטים הוא מתרחש על ידי 2 אנזימים: RNAseH שמסוגל לסלק את כל הנוקליאוטידים חוץ מהראשון, והנוקליאוטיד הראשון מסולק על ידי.FEN1 השלב האחרון הוא סיום ההכפלה. גם שלב זה מבוקר מצורה מיוחדת- יש רצפים מיוחדים שמסמנים את הסיום וחלבונים מיוחדים שמסמנים אותם (ב-.E coli יש רצפים מיוחדים ליד אתר ה- ;origin כרומוזום מעגלי). באוקריוטים יש מערכת שלמה שמטפלת בטלומרים.
ב. מספר שבועות אחרי שווטסון-קריק פרסמו את המודל שלהם (ב- 53') הם פרסמו מודל לרפליקציה של ה- DNA ה. - DNA הדו-חוטי נפתח, ונוקליאוטידים מסתדרים מול הבסיסים, בהתאם ל-.template ווטסון-וקריק לא פרסמו מודל אנזימטי לתהליך. הם חשבו שהנוקליאוטידים מגיעים, ו"נדבקים" באופן לא ידוע (ספונטאני). גישה זו הטרידה את קורנברג, שחשב שהתהליך מתווך על ידי אנזים. ואכן אחרי מספר שנים הם הראו שישנו אנזים שמסוגל לפלמר.DNA לאנזימים האלו יש כמה תכונו משותפות: הגילוי של DNApoly ושל RNApoly הכניס סוג חדש של אנזימים שבו יש קשר לא רק בין אנזים לסובסטראט אלא גם לגורם שלישי ה-.template אנזימים מסוגים אלו יכולים להיות מכמה סוגים:.DNA dependant polymerase הוא DNApolyI בולטימור ותמינג גילו מאוחר יותר -RNA dependant DNA polymerase המסוגלים לסנטז DNA על.(reverse transcriptase) RNA DNA dependant RNApoly RNA dependant RNA poly ל- DNA dependant polymerase יש כמה תכונות: הוא חייב.template כאשר DNApoly פועל על template טבעי (רצף שמכיל את כל ארבעת הבסיסים) האנזים חייב לקבל את כל הנוקליאוטידים; אם חסר לו אחד הוא יפול. DNApoly אינם מסוגלים לסנטז ;de-novo DNA הם יכולים רק להאריך שרשרת קיימת (לא לבנות אחת מאפס). הפעולה שלהם כיוונית, והיא משותפת לכל הפולימראזות הידועות. הוא קורא מכיוון 3 ל- 5 ומסנטז מ- 5 ל- 3 ל. - DNApoly אין ספציפיות ל- template כלומר אנזים אוקריוטי יכול לעבוד על גנום פרוקריוטי ולהיפך. בריאקציית הפולימריזציה משתחרר פירופוספאט, ולכן הריאקציה נוטה מאד לכיוון הזה. בסינטזה של DNA ה- primer מתייחס אך ורק לשרשרת שאליה מתווסף הנוקליאוטיד. הקצה של ה- primer המספק את קבוצת ה- 3-OH נקרא.primer terminus ה- template מספק במידה רבה (אך לא במידה מוחלטת) את רצף הנוקליאוטידים לשרשרת המסונטזת. ה- template מספקת גם את כיוון הסינטזה. ה- template והפריימר מייצגים 2 מושגים שונים, ורק הצירוף שלהם פעיל במהלך סינטזה. אין סינטזה של DNA כאשר רק אחד מהם קיים. כרומוזומים באים בטבע ב- 4 סוגים: linier dsdna.1 circular dsdna.2 linier ssdna.3 circular ssdna.4 אף אחד מהם לא משמש באופן ישיר כ-,primer ולכן הם אינרטיים לפולימראז כשהם לעצמם. - dsdna circular אין קצוות ב- linier dsdna באופן תיאורטי הקצה יכול לשמש primer ואין.terminus הטבע פותר את הבעיה הזו בכמה דרכים: יש אנזימים שיכולים ליצור nick במקופ מסויים. חלק מהפולימראזות מסוגלים להיקשר לקצה 3-OH כזה (כמו (polyi ולהשתמש בו כאתר לשעתוק. זה יכול להביא ל- strand displacement (הדחה של הסרט הקיים). מנגנון זה משמש במערכות רפליקציה מסוימות. במקרים אחרים הפולימראז רץ על ה- template תוך כדי שהוא מפרק את הגדיל הקיים (תהליך זה יכול לשמש לרקומבינציה או לתיקון,DNA אבל לא לרפליקיה).
דבר דומה מתרחש ב- DNA כאשר יש "פערים" של נוקליאוטיד אחד או יותר. gap יכול להתרחש כשמסלקים,primer לדוגמא. פערים אלו נסגרים על ידי פולימראזות. אנזימים שמשתתפים בתהליכים כאלו נדרשים לפרוססיביות נמוכה- יכולים להיכנס לאזורים קטנים, ולסנטז רצפים קצרים בלבד. רוב המערכות שנחקרו הן דו-חוטיות, שם מתרחשת התכה של ה-,DNA ובניה של פריימר על גביו. כרומוזומים חד-חוטיים פחות קיימים, אבל הם קיימים. לוירוסים ממשפחת Parvo יש כרומוזומים ליניאריים חד-חוטיים. במשפחה זו יש תת-משפחה של adeno-) AA-viruses,(associated שבו יש וירוסים שלא יכולים להדביק באופן עצמאי, וצריכים הדבקה על ידי וירוס אחר גדי להתפשט. לוירוסים אלו יש template ו- primer ב. קצה הגנום שלהם יש רצפים פולינדרומיים. רצפים אלו יכולים להתקפל אחד על השני וליצור מבנה של,hairpin שגורמת לקיפול של אחד הגדילים של ה-,DNA כך שישמש primer של הגדיל השני (כלומר- נעשה שימוש בגדיל אחד, שישמש DNA חד-חוטי מעגלי הוא חסר קצוות, ולכן הדרך היחידה לבצב בו סינטזת DNA היא לסנטז עליו קטע קצר של RNA או DNA או לייבא קטע כזה ממקום אחר שישמש כ-.terminus המחקר במערכת הזו סיפק יותר מידע מאשר כל מערכת אחרת. מערכת כזו- שמחייבת סינטזה של פריימר היא גלאי מצוין למערכות כאלו. כללים בסיסיים שנוגעים להכפלת כרומוזומים: dsdna מוכפל בצורה סמי-קונצרבטיבית. המודל הוצע על ידי ווטסון וקריק ב- 53, אבל הוכך על ידי ניסוי מסלסון-שטאהל חמש שנים מאוחר יותר. כרומוזומים אינם מתחילים את הכפלתם ברצף אקראי, אלא ברצף מוגדר (ה- origin of.(replication ברנר, זאקו וקוזין הציעו מודל שנקרא רפליקון. כשהם הציעו את המודל הזה היה קיים כבר הידע על הריבוזום ועל האופרון, אך לא היה מוכר גורם שמבקר את הכפלת ה-.DNA הם הבינו שבמערכת שבה ה- DNA מבקר את עצמו חייבים להיות 3 גורמים: (1) רצף מסויים שהם קראו לו replicator (היום קוראים לו.(origin of replication (2) חייב להיות חלבון המכיר את הרצף הזה. הם קראו לו initiator (היום נקרא.(origin binding protein (3) חייב להיות קשר בין המערכת הזו למערכות הסינטזה שיעורר אותה. המודל הזה נשאר נכון עד היום. הרפליקון מציין את יחידת הבקרה על הכפלת ה-.DNA קטע DNA שמסוגל לבקר את הכפלת ה- DNA הוא רפליקון. היכולת שלנו לייצר חלבונים משובטים (חלבוני עיזים נובעת מהיכולת שלנו להכיר קיים הבדל בין רפליקונים אוקריוטים ופרוקריוטים. בפרוקריוטים כל הכרומוזום נשלט על ידי רפליקון אחד (או רפליקון פעיל אחד). לעומת זאת- באוקריוטים הכרומוזום הוא צירוף של אלפי רפליקונים (הכרומוזום מחולק לרפליקונים, שכל אחד מהם באורך של 100kbp באדם או 40kbp בדרוזופילה). הבקרה על התחלת סינטזת ה- DNA מתרחשת על ידי אותם אזורים, ולאחר שהתהליך החל, לתא כמעט אין שליטה עליו. אזורים אלו צריכים לשלוט על התזמון של ההכפלה phase) s בתאים אנימאליים). ולדאוג לכך שאיניציאציה מתקיימת רק פעם אחת בכל מחזור תא. קיימת מערכת שלמה של licensing שדואג שלא תתחיל רפליקציה נוספת לפני שהראשון הסתיים. ההכפלה היא תהליך מורכב (בזמן ההתפתחות העוברית צריך הכפלות כל כמה דקות). לא כל הרפליקונים מוכפלים באותו זמן: יש כאלו שמוכפלים לפני אחרים, ויש על הסדר בקרה הדוקה. קיים תיאום בין שעתוק של גנים מסוימים לבין המעד שבו רפליקון מתחיל לעבוד. יש יוצאים מהכלל לכך ש- DNA מוכפל רק פעם אחת בכל מחזור תא: בתאים קיים באופן טבעי תהליך של אמפליפיקציה של גנים. זה קיים בעיקר בעוברים והוא נועד להגביר כמות של מסויימת של גנים. גם DNA מיטוכנדריאלי מוכפל באופן עצמאי מה- DNA הגרעיני, והוא יכול להכפיל את
עצמו מספר פעמים בכל מחזור. כאשר מתרחשת הדבקה על ידי נגיפים היא לא בהכרח כפופה למנגנון ההכפלה. בחיידקים ניתן לבצע התחלות חדשות של סינטזה תוך כדי הרפליקציה של החיידק. כלומר- ברגע שהוכפל ה- origin הוא יכול לשמש שוב כ-.origin זה מה שקורה בחיידקים בשלב לוגריתמי. כרומוזום של עובר דרוזופילה מכפיל את עצמו במשך מספר דקות. מהירות ההכפלה של כרומוזום אוקריוטיאיטי הרבה יותר מאשר בפרוקריוטים, אבל ריבוי אתרי ההכפלה יכול לגרום לכך שהם יכולים להאיץ את מהירות ההכפלה. גרעינים פשוטים יש בחיידקים, שמרים (פרוטוזואה) ובמורכבים יש במשפחת המטאזואה (רב- תאיים). בגנים מורכבים ה- Origin מורכב מ- core ומ-.auxiliary sequences ה- core מורכב מכמה רצפים: origin binding protein רצף ההכרה שאותו מכיר ה- ORE (DNA unwinding element) רצף בעל פרופיל התכה נמוך יותר -DUE rich -AT לעיתים קרובות יש כיפיפים ברצף הזה. באופן עקרוני, ה- ORE חוזר במספר רב של עותקים (באותו אזור). ברגע שהחלבון נקשר לרצף זה הוא גורם ל- 2 תהליכי מפתח: הוא גורם להתכה מקומית (לא קטאליטי) של רצף ה-.DUE ברגע שהוא קשור ל- origin הוא מגייס חלבונים אחרים שעוסקים בסינטזת ה- DNA ויוצר קומפלקס חלבוני (באמצעות אינטראקציות חלבון חלבון) שמשתתפים בתהליך. רצף ה- DUE הוא הרצף שבו תתרחש הפתיחה הראשונה של הסליל הכפול, ושם תתחיל ההכפלה. לאזור זה יש יציבות נמוכה, וצריך להשקיע פחות אנרגיה כדי להתיך אותו. אנחנו לא מכירים חלבונים שנקשרים לאתר הזה, ואנחנו יודעים שיש חשיבות למרחק בין אתרי ה- DUE לרצף ה-.ORE אנחנו לא יודעים את התפקיד של ה-,AT אבל אנחנו יודעים שהוא מערער עוד יותר את המבנה של ה-.DUE כלומר- האנרגיה הדרושה להתכה של אזור ה-,DUE בשילוב עם המבנה המיוחד שמשרים רצפי ה- AT נמוכה יותר. הפתיחה של ההליקס מאד חשובה, משום שהיא מאפשרת את הקישור של הליקאז לאתר הזה. ההליקאז מסוגל להיקשר רק לאזור חד חוטי. בעצם- הגורם העיקרי שמחזיק את הגדיל הם קשרי העירום, ואזורים אלו מפחיתים את הקשרים האלו. יש דמיון ברצפי ה- core בין מינים שונים של חיידקים. יש לנו גם רצפים שאינם קשורים לליבת האתר (ואינם דרושים לעצם התחלת התהליך) אבל מתפקדים כגורמי בקרה על תדירות התהליך. אלו הם רצפי,AUX שאליהם נקשרים enhancers, silencers וכיו"ב. אותם גורמים שמבקרים את השעתוק- מבקרים את ההכפלה. רצפים אלו אמנם אינם דרושים לתחילת התהליך, אבל הם קובעים במידה מסויימת את התדירות שלו (והמהירות שלו). זה קיים בנגיפים ובמערכות אחרות. מזלג ההכפלה שהתחיל ב- origin יכול ללכת ל- 2 הכיוונים או רק לכיוון אחד. כאשר ההכפלה מתרחשת ב- DNA מעגלי (דו-חוטי) נוצר מבנה מישורי שדומה לאות היוונית θ. מבנים אלו קוראים מבני תיטא או Cairns (ע"ש החוקר שגילה אותם). זה התגלה באמצעות מעקב אחרי צורת ה- theta form באמצעות שימוש בנוקליאוטידים רדיואקטיביים, ומעקב אחרי התפתחות הצורה ע"ג סרט צילום. שיטה זו נקראת אוטו-רדיוגרפיה. את כיוון המזלג ניתן לקבוע באמצעות שיטה קצת שונה: נותנים פולס של תימין רדיואקטיבי. כאשר חושפים מולקולות כאלו לסרט צילום תמיד רואים 2 קצוות שבהם יש סימון רדיואקטיבי. יש לנו דרך נוספת לקבוע את כיווניות מזלג ההכפלה: דנטורציה חלקית. חלקים שונים במולקולה יציבים יותר או פחות בהתאם לזיווג הבסיסים. המקומות האלו קבועים בהתאם למולקולה.
אנחנו יכולים להתיך את המולקולה באופן חלקי (במולקולות זהות תמיד נקבל את אותו דגם התכה). דגמים אלו ניתן לראות במיקרוסקופ אלקטרונים. מכיוון שכך- בועיות ההכפלה יכולים לשמש כסמנים קבועים ויציבים על גבי מולקולת ה-.DNA באופן זה ניתן לאתר את המרחק שבין בועית ההתכה, לבין אתר תחילת ההכפלה. ניתן גם למדוד את המרחק שבין בועית ההתכה למזלגות ההכפלה (אם המיקום של שני המזלגות משתנים, ביחס לבועית ההתכה- ההכפלה מתרחשת ב- 2 הכיוונים). לנגיף ה- herpes simplex יש DNA ליניארי, כאשר אתר ה- origin שלו נמצא בשליש הדרך. במקרה זה נפתחת בועית הכפלה דו כיוונית, שמתקדמת בקצב שווה פחות או יותר. מזלג אחד מגיע לקצה מהר יותר, שם הוא יוצר Y. form זהו מבנה אופייני להכפלה של DNA ליניארי. צורה אופיינית נוספת היא צורת סיגמא, והיא אופיינית ב-.rolling circle זה מתרחש ב- DNA דו חוטי מעגלי, כאשר ההכפלה מתחילה ב-,nick והסינטזה דוחקת את הסרט הקיים ויוצרת זנב.DNA במערכות כאלו, בדרך כלל- לאחר שיחידת אורך של גנום קולפה, היא תיחתך ותיארז בתור נגיף. צורה אחרת היא.(displacement loop) D loop מבנה זה אופייני להכפלה של DNA מיטוכונדריאלי ( Aהוא דו-חוטי מעגלי, בגודל.(16.5kbp ב- DNA כזה לכל אחד מ- 2 הגדילים יש origin משלו, והם לא מתחילים את ההכפלה בצורה סינכרונית. ההכפלה מתחילה בסינטזה של סרט H ("כבד") על גבי שרשרת L, תוך כדי דחיה של סרט ה- H הקיים. בזמן הכפלה של הגנום אוקריוטי ניתן להבחין בבועיות הכפלה בגדלים שונים- כלומר האיניציאציה החלה בזמנים שונים.
נסתכל על מערכת אחת ביתר פירוט-.phi-X174 מדובר בנגיף בקטריאלי, שיש לו גנום חד-חוטי מעגלי. הנגיף הזה נספח לתאי.E coli וסלמונלה ולהדביק את התאים. כשהוא התגלה הוא היווה שאלה קשה לכל מודל הכפלת ה- :DNA איך אפשר להכפיל גנום חד חוטי במנגנון במי-קונסרבטיבי. זה נפתר כאשר התגלה שהשלב הראשון הוא סינטזה של הגדיל המשלים. גנום זה היה הגנום הראשון שרוצף במלואו ב- 1975, עבורם זה היה הישג אדיר. בריצוף של הגנום התגלה דבר מפתיע- הגנום היה קטן מכדי להכיל את כל הגנים שידענו שהם קיימים. הגנום הזה מאד דחוס, ונקרא ביותר ממסגרת קריאה אחת. בוירוס זה יש לנו 2 מסגרות קריאה שונות לאותו רצף, לייצור של 2 חלבונים. כאשר הואמדביק תאים שוא משיל מעליו את הקפסיד, משחרר את ה-,DNA ומשתלט על המערכת החיידקית. הוירוס משתמש במערכות החיידק להשלים את הגדיל המשלים שלו. הפאג' מגיע עם סרט ה- (+), והסינטזה של סרט ה- (-) נעשית באופן מלא על ידי מערכות החיידק (ללא חלבונים ויראליים). לאחר מכן יש הכפלה של הגנום הויראלי הדו-חוטי ולאחר מכן יצירה של כרומוזומים חד-גדיליים. 2 תהליכים אחרונים אלו מתווכים על ידי החלבון,gpA שנעסוק בו בהרחבה. כל תהליך ההדבקה מתרחש תוך 20 דקות- אחרי זמן זה יש בתא כבר כמה מאות חלקיקי וירוס, התא כבר עובר ליזיס ומפזר אותם. בדרך כלל נגיפים לא מביאים איתם הרבה גנים: הם מביאים איתם גנים של הקפסיד, וכמעט תמיד יש להם רצף origin שמזוהה על ידי התא שאליהם הוירוס חודר, ומאפשר להם להשתלט עליו.